PCR روش تکنیکی است که برای تکثیر بخشی از DNA مورد¬ نظر یا تولید نسخه¬های بسیار زیاد به کار می¬رود. به عبارت دیگر، PCR به ما امکان می¬دهد میلیون¬ها نسخه از یک توالی DNA خاص را از یک نمونه کوچک، در بعضی مواقع حتی یک نسخه، تهیه کنیم.
به گزارش ایفدانا به نقل از روابط عمومی معاونت غذا و دارو دانشگاه ایران در همه گیری اخیر بیماری کرونا، متخصصان بهداشت عمومی بر آزمایش، ردیابی افراد آلوده و ردیابی ارتباطات آنها به عنوان یک استراتژی موثر برای کاهش شیوع ویروس تأکید کردهاند. چندین روش تشخیصی برای شناسایی ویروس کرونا در آزمایشگاههای بالینی، تحقیقاتی و بهداشت عمومی گزارش شده است.
برخی از آزمایشات با شناسایی RNA ویروسی و سایر آزمایشات بطور مستقیم با شناسایی آنتیبادیهای میزبان، عفونت را تشخیص میدهند. یک آزمایش تشخیصی در طی همهگیری باید به تصمیمگیری بالینی مناسب در مدت زمان کوتاه کمک کند. روشهای تشخیصی که اخیرا جهت شناسایی بیماری Covid-۱۹ گزارش شدهاند برحسب توانهای عملیاتی مختلف، عملکردهای تحلیلی، زیرساختهای مورد نیاز و مدت زمات جوابدهی، تفاوتهای عمدهای را دارا میباشند. با درنظر گرفتن این عوامل، امروزه روش RT-PCR به عنوان پرکاربردترین روش تشخیص مستقیم بیماری کرونا استفاده میگردد. در این مقاله، ما به صورت مختصر روش PCR را توضیح میدهیم و به صورت اختصاصی با جمعبندی گزارشهای علمی بیان شده در مقالات علمی معتبر و سازمانهای نظارتی مربوطه، به مزایای روش RT-PCR در شناسایی بیماری Covid-۱۹ میپردازیم. در نهایت، دربارهی محدودیتهای روش بیان شده، بحث میکنیم و دیدگاه محققین در مورد آزمونها و تستهایی که در آینده نزدیک، جایگزینهای معتبرتر و سریعتر در شناسایی بیماری کرونا میشوند را اشارهای خواهیم نمود.
کلمات کلیدی: واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR)، دستگاه Thermo Cycler ، بیماری Covid-۱۹ ، DNA، RT-PCR
بخش ۱: مقدمه
تکنیک PCR اولین بار در سال ۱۹۸۵ توسط دانشمندی به نام کری مولیس ابداع شد. اهمیت این روش از آن جا آشکار میشود که این دانشمند به علت ابداع این روش در سال ۱۹۹۳ جایزه نوبل شیمی را از آن خود کرد. PCR خلاصهای از یک روش ساده اما بسیار مفید در زیست شناسی مولکولی به نام واکنش زنجیره ای پلیمراز است. این روش تکنیکی است که برای تکثیر بخشی از DNA مورد نظر یا تولید نسخههای بسیار زیاد به کار میرود. به عبارت دیگر، PCR به ما امکان میدهد میلیونها نسخه از یک توالی DNA خاص را از یک نمونه کوچک، در بعضی مواقع حتی یک نسخه، تهیه کنیم. این یک فرآیند حیاتی برای طیف وسیعی از فناوریهای ژنتیکی است و در حقیقت، توسعه مجموعهای از فناوریهای جدید را امکانپذیر کرده است.
PCR آنچه در هستهی سلولها هنگام کپی شدن (تکثیر) قبل از تقسیم سلولی اتفاق میافتد را تقلید میکند، اما در شرایط کنترل شده در آزمایشگاه انجام میشود. دستگاهی که مورد استفاده قرار میگیرد دستگاه PCR یا ترموسایکلر نامیده میشود. لولههای آزمایش حاوی مخلوط DNA مورد نظر در دستگاه قرار میگیرند و دستگاه دما را متناسب با هر مرحله از فرآیند تغییر میدهد. برای انجام آزمایشPCR ، نمونه استخراج شده که شامل الگوی DNA هدف است به یک لوله حاوی آغازگرها، نوکلئوتیدهای آزاد (dNTPs) و Taq پلیمراز اضافه میشود. مخلوط واکنش PCR در دستگاه ترموسایکلر قرار میگیرد. دستگاه ترموسایکلر در طی مراحل اتوماتیک و برنامه ریزی شده، دمای مخلوط PCR را افزایش و کاهش میدهد که در نهایت به صورت تصاعدی نسخههای توالی‌های هدف را تکثیر میکند
.
PCR در طی سیکلهای متوالی انجام میپذیرد که هر سیکل شامل سه مرحله است:
مرحله اول: Denaturation
هنگام تکثیر DNA ، دو رشته مارپیچ دوگانه DNA باید جدا شوند. جداسازی با افزایش دمای مخلوط اتفاق میافتد و باعث میشود پیوندهای هیدروژن بین رشتههای مکمل DNA شکسته شود. به این فرآیند دناتوراسیون گفته میشود.
این مرحله در درجه حرارت ۹۳ تا ۹۵ درجه سانتیگراد صورت میپذیرد.
مرحله دوم: Annealing
در این مرحله آغازگرها (Primer) به DNA الگو هیبرید میشوند. آغازگرها، مولکولهای DNA تک زنجیرهای کوتاه هستند که به دو انتهای توالی DNA در منطقه مورد نظر متصل میشوند. در این مرحله درجه حرارت واکنش کاهش مییابد. (دمای ۵۰ تا ۵۶ درجه سانتیگراد)
مرحله سوم: Extension
رشته های جدید DNA با استفاده از رشتههای اصلی به عنوان الگو ساخته میشوند. DNA پلیمراز پروتئینی است که بر روی DNA تک رشته حرکت میکند و با استفاده از نوکلئوتیدهای آزاد، هر نوکلئوتید را در مقابل نوکلئوتید مکمل خود قرار میدهد. این امر غالبا به کمک آنزیم Taq polymerase صورت میگیرد، آنزیمی که در اصل از باکتری گرمادوست به نام Thermus aquaticus جدا شده است. ترتیب اضافه شدن نوکلئوتیدهای آزاد با توالی نوکلئوتیدها در رشته DNA (الگو) اصلی تعیین میشود. فعالیت این آنزیم در دمای ۷۲ درجه سانتیگراد صورت میپذیرد.
نتیجه یک چرخه PCR دو توالی دو رشته ای DNA هدف است که هر یک حاوی یک رشته تازه ساخته شده و یک رشته اصلی است. این چرخه بارها تکرار می شود (معمولاً ۲۰-۳۰) زیرا بیشتر فرآیندهای استفاده از PCR به مقدار زیادی DNA احتیاج دارند. فقط ۲ تا ۳ ساعت طول می کشد تا یک میلیارد نسخه از آن تهیه شوند.
در شکل ۱ فرآیند واکنش زنجیرهای پلیمراز به نمایش گذاشته شده است.
شکل۱. فرآیند واکنش زنجیرهای پلیمراز [۱]
یکی از انواع PCR، RT-PCR (PCR معکوس) میباشد. این نوع واکنش ترکیبی از وارونویسی (Reverse Transcription) و PCR است که باعث ازدیاد توالی مورد نظر از الگوی RNA میشود. توالی مورد نظر در قطعات DNA که محصول PCR هستند، تظاهر پیدا میکند. حساسیت این روش به مراتب بیشتر از انتقال RNA و هیبرید کردن با پروب نشان دار است. حساسیت RT-PCR باعث شده است که بتوان mRNA های بسیار کمیاب و mRNA های حاصل از تعداد اندک سلول با مقادیر ناچیز بافت را تشخیص داد. از دیگر انواع PCR میتوان به PCR لانهای و ARMS-PCR اشاره کرد.
اولین بار از PCR برای تکثیر قطعه ای از DNA رمزگردان بتاگلوبین انسان برای تشخیص کم خونی داسی شکل در جنین استفاده شد. امروزه کاربردهای مختلفی از PCR در تشخیص بیماری ها صورت میگیرد. امروزه به کمک PCR میتوان قطعه هدف DNA را به طور اختصاصی تغییر داد. علاوه بر ان به کمک پرایمرهای مناسب میتوان به طور مشخص، نوکلئوتیدهایی را در محصول PCR وارد یا حذف نمود و یا جایگزین نوکلئوتیدهای قبلی نمود. امروزه از مهمترین کاربرد PCR میتوان به شناسایی بیماری Covid-۱۹ اشاره نمود. درادامه به صورت مفصل در این مورد صحبت خواهد شد.
جهت تقویت بخشهای DNA از طریق واکنش زنجیرهای پلیمراز و یا تسهیل سایر واکنشهای حساس و تشخیص سریع از دستگاهی به نام چرخاننده دما یا به اصطلاح Thermo Cycler استفاده میشود. این دستگاه دارای یک بلوک حرارتی با چاهکهایی است که میتوان Micro Tube های مخلوط واکنش را در آن قرار داد. سپس این دستگاه در مراحل مجزا و از قبل برنامه ریزی شده، دمای بلوک را متناسب با مرحله مد نظر بالا و پایین می آورد.
معمولا یک واکنش PCR نیاز به DNA الگو، دو عدد پرایمر، چهار نوع دی اکسی نوکلئوتیدتری فسفات (dNTP)، غلظت مشخصی از بافر منیزیم کلراید (MgCl۲) و نوعی از آنزیم DNA پلیمراز مقاوم به حرارت (مشخصا Taq پلیمراز) دارد. اقلام فوق را در یک ویال کوچک (Micro Tube) ریخته و در داخل چرخاننده دما قرار میدهند. چرخاننده دما معمولا دارای چندین برنامه است که توسط اپراتور قابل تغییر میباشد. به طور کلی یک برنامه شامل چندین سیکل میباشد. یک سیکل معمولا شامل چند مرحله است.
- حرارت دادن نمونه در دمای حدود ۹۵ درجه سانتی گراد برای چند دقیقه تا DNA الگو دناتوره شود.م
- پایین آوردن دما به حدود ۶۵-۵۰ درجه سانتی گراد بین ۳۰ ثانیه تا ۳ دقیقه، تا پرایمرها به DNA الگو متصل شوند.
- حرارت دادن در دمای ۷۲ درجه بین ۳۰ ثانیه تا ۳ دقیقه برای ساخته شدت رشتههای جدید.
- معمولا یک واکنش PCR دارای ۲۵ تا ۴۰ سیکل میباشد. کل زمان واکنش بسته به دستگاه مورد استفاده متفاوت میباشد و تحت سیستم حرارتی و برودتی دستگاه قرار دارد.
سیستم مرسوم حرارتی و برودتی مورد استفاده در چرخانندههای دما، استفاده از بلوک حرارتی با روش ترموالکتریک (Peltier effect) میباشد. بلوکها دارای چاهکهایی هستند که قابلیت تطبیق با ویالهای مختلف را دارند. به این ویالها میکروسانتریفیوژ تیوب نیز میگویند. بعضی از بلوکها قابلیت جای دادن پلیتهای ۹۶ چاهکی را نیز دارند. اپراتور میتواند برنامههای مورد نظر خود را با دماها و زمانهای دلخواه وارد دستگاه کند. افزایش یا کاهش دمای بلوک تا دمای وارد شده در برنامه را Ramping مینامند و معمولا به میزان ۱ الی ۳ درجه سانتیگراد در ثانیه صورت میگیرد. اخیرا چرخانندههای حرارتی جدیدی ساخته شدهاند که به آنها Capillary air thermal cycler میگویند. یک حباب هالوژنی (به جای بلوک فلزی)، اطاقک پر شده با مواد را حرارت میدهد و یک دریچه که با جریان الکتریکی فعال میشود، مسئول سرد کردن ویالها است. اطاقک دارای یک فن میباشد که جریان هوا را در آن برقرار میکند.
در شکل ۲ نمونهای از دستگاه چرخاننده دما را مشاهده مینمایید.
شکل ۲- نمونهای از دستگاه چرخاننده دما (PCR) [۲]
بخش ۲: نقش حیاتی PCR در شناسایی بیماری کووید
بیماری همهگیر ویروس کرونا (COVID-۱۹) و تلاشهای انجام شده برای مهار این بیماری، یک بحران بهداشتی در سراسر جهان ایجاد کرده است که تمام بخشهای زندگی انسان را تحت تأثیر قرار میدهد. با پیشرفت تدریجی زمان، COVID-۱۹ به عنوان یک پاندمی توسط سازمان بهداشت جهانی (WHO) اعلام شد که دارای یک پتانسیل بسیار خطرناک برای تأثیرگذاری بر میلیونها زندگی در همه کشورها، به ویژه در کشورهای دارای سیستم بهداشتی ضعیف تر است. این ویروس به دو دلیل اساسی کشنده است. اولاً، این ویروس جدید است و هیچ واکسنی برایش کشف نشده است، و ثانیاً، از طریق تماس مستقیم یا غیر مستقیم با فرد مبتلا به راحتی منتقل میشود.
برای افزودن به آمارهای وحشتناک این بیماری، ایالات متحده آمریکا که یکی از پرچمداران پیشرو در پیشرفت بهداشت و درمان است، بیشترین تعداد قربانیان COVID-۱۹ را ثبت کرده است. پس از آن کشورهای برزیل ، هند ، روسیه ، آفریقای جنوبی قرار دارند و این لیست برای ۲۱۵ کشور در سراسر جهان ادامه دارد. تعداد موارد جدیدی که هر روز گزارش میشود با سرعت بیشتری در حال افزایش است و دولتها و مقامات عالی کشورها را در سراسر جهان مجبور میکند قرتطینه را برای اطمینان از فاصله اجتماعی برای مهار بیماری تحمیل کنند.
چندین روش تشخیصی برای شناسایی ویروس کرونا در آزمایشگاههای بالینی، تحقیقاتی و بهداشت عمومی استفاده شده است. آزمایشات مستقیم با شناسایی RNA ویروس، عفونت را مستقیماً تشخیص میدهند، در حالی که آزمایشات غیرمستقیم آنتیبادیهای ضد ویروس را در میزبانی که در معرض بیماری است اندازه گیری میکنند. یک روش آزمایش تشخیصی باید از حساسیت و دقت کافی برخوردار باشد تا تصمیمات بالینی مناسب را به سرعت در طی یک بیماری همه گیر اتخاذ کند.
Real Time PCR پرکاربردترین روش برای تشخیص مستقیم SARS-CoV-۲ است. از روش ایمونواسی برای اندازهگیری آنتیبادی علیه SARS-CoV-۲ استفاده میشود. روشهای نوظهور با استفاده از CRISPR نیز جهت شناسایی بیماری کووید گزارش داده شده است. جدا از روشهای آزمایشگاهی RT-PCR و ایمونواسی، در چند ماه گذشته چندین روش ازجمله POC و تستهای Rapid در دسترس قرار گرفته است. روشهای اصلی تشخیص در شکل۳ نمایش داده شده است.
شکل۳- روشهای تشخیصی موجود جهت شناسایی بیماری کووید [۳]
سازمانهای نظارتی مانند سازمان بهداشت جهانی (WHO) و سازمان غذا و داروی ایالات متحده (FDA) استفاده از تعدادی از روشهای تشخیصی را تأیید کردهاند، در حالی که برخی از روشهای جدید تحت مجوز استفاده اضطراری (EUA) تأیید مشروط را دریافت میکنند[۴].
بسته به تجهیزات و روش مورد استفاده، نتیجه آزمایشات انجام شده وابسته به پروتکل جمعآوری نمونه، معرفهای استفاده شده، پتانسیل آلودگی متقابل و نیازهای ذخیره سازی نمونه و معرف میباشد. این عوامل باید در هنگام انتخاب روش تشخیصی مطمئن و سریع، در نظر گرفته شود تا به تصمیم گیری مناسب و اقدامات سریع بهداشت عمومی کمک کند.
روش های تشخیص مولکولی شامل تجزیه و تحلیل اسیدهای نوکلئیک موجود در نمونه برای شناسایی ویروس است. متداولترین روش تشخیص آزمایشگاهی برای تشخیص COVID-۱۹ ، روش RT-PCR است. جهت تشخيص و نظارت بر بيماريهاي ويروسي مختلف از جمله SARS-CoV و MERS-CoV نيز از همين روش استفاده شده است. تعداد زیادی از پرایمرها و آغازگرهای تجاری مورد استفاده در RT-PCR برای تشخیص SARS-CoV-۲ وجود دارد. آزمایش RT-PCR بسته به نوع ورژن PCR کمتر از یک ساعت تا چند روز به نتیجه میرسد. روش RT-PCR میتواند در رویکردهای یک یا دو مرحله ای انجام شود. روش یک مرحله ای سریعتر است که در آن RT و DNA پلیمراز با هم ترکیب میشوند تا واکنش مربوطه خود را در همان لوله واکنش انجام دهند و یک روش ترجیحی برای تشخیص SARS-CoV-۲ است. روش دو مرحلهای شامل RT از RNA در یک لوله و پس از آن پلیمریزاسیون DNA در یک لوله واکنش جداگانه است. بسته به نوع سنجشی که صورت میپذیرد، یک دستگاه RT-PCR میتواند همزمان یک تا صدها نمونه را آزمایش کند. نتیجه آزمایش RT-PCR به جمعآوری نمونه، پرایمرها و پروبهای مورد استفاده، تجزیه و تحلیل منحنیهای فلورسانس، استفاده از کنترلهای مناسب و تنظیمات کنترل دما بستگی دارد. برای بررسی آلودگی متقابل نمونه از کنترل منفی و برای ارزیابی یکپارچگی شیمیایی معرف ها، پرایمرها و پروب ها از کنترل مثبت استفاده میشود. علاوه بر این کنترل ها، CDC ایالات متحده استفاده از کنترل نمونه انسانی (HSC) را برای اطمینان از لیز موفقیت آمیز و یکپارچگی معرفهای استخراج و به حداقل رساندن نتایج منفی کاذب با اطمینان از جمعآوری کافی مواد سلولی انسانی توصیه میکند [۵].
اگرچه روش PCR معکوس مزایای زیادی دارد، اما از معایب آن میتوان به هزینههای بالای آزمایش معمولی RT-PCR و امکانات مورد نیاز جهت انجام این آزمایش از جمله دستگاههای PCR اشاره کرد. از معایب دیگر میتوان زمانبر بودن این آزمایش از لحظه نمونه برداری تا انتقال نمونه به آزمایشگاه مورد تایید و انجام آزمایش در آن محل اشاره نمود که چندین روز گاها زمان میبرد. علاوه بر این، مراحل آمادهسازی و سنجش نمونه به نیروی انسانی آموزش دیده نیاز دارد. این معایب استفاده گسترده تر از این فناوری را در طی همهگیری ویروس کرونا محدود میکند. علاوه بر این، تقاضای زیاد در هنگام شیوع همهگیری باعث کمبود سواب، تجهیزات محافظت شخصی، واکنشگرهای PCR و تجهیزاتی مانند ترموسایکلرها و کابینت های سطح ۲ ایمنی زیستی میشود. از آنجایی که روش های RT-PCR مکانهای هدف خاص را تقویت میکنند، اگر منبع هدف خاص در نمونه وجود نداشته باشد، نتایج منفی گزارش میشود. در طی بیماری همهگیر COVID-۱۹ ، نگرانی فزاینده ای نیز در مورد غیرقابل دسترس بودن روشهای آزمایش مبتنی بر RNA و کمبود جهانی معرف وجود دارد[۶].
بخش ۳. چشماندازهای آینده:
در میان روشهای مختلف موجود برای تشخیص COVID-۱۹ ، RT-PCR مطمئنترین و پرکاربردترین روش است. در موارد اضطراری همه گیری، کمبود منابع مانند کیتهای PCR معمول است. بنابراین داشتن چندین گزینه برای روشهای تشخیصی مهم است. روشهای RT-PCR که در حال حاضر انجام میشود، هزینه بر است و بنابراین بسیاری از کشورها، به ویژه کشورهای کم درآمد، نمیتوانند تعداد کافی آزمایشات COVID-۱۹ را برای غربالگری جمعیت بیشتر انجام دهند. تضمین کیفیت و چارچوبهای نظارتی مربوط به آزمایشهای شناسایی کوووید همچنان یک چالش است. چندین مورد از فراخوانی کیتهای آزمایش COVID-۱۹ در چندین کشور به دلیل کیفیت مشکوک و پایین آنها گزارش شده است. فقدان یک استاندارد مرجع ثابت، استفاده از روشهای مختلف جمع آوری و آماده سازی نمونه، و درک ناقص از پویایی ویروسی در طول دوره عفونت، ارزیابی دقیق و دقت تشخیصی بسیاری از سنجشهای جدید SARS-CoV-۲ را مختل میکند [۷].
تکنولوژیهای جدیدی مانند تشخیصهای مبتنی بر CRISPR یا RT-LAMP و گسترش پیشرفت تکنولوژی میکروفلوییدهای کاغذی، امکان تشخیص سریع، راحت، ارزان، قابل حمل و مطمئن را فراهم نمودهاند. نمونهای از چنین سیستمهایی برای تشخیص بیماری کووید، توسط Yang و همکارانش در مقاله [۸] آورده شده است. با توجه به این واقعیت که احتمال ابتلا به COVID-۱۹ مانند ویروس های آنفولانزا در جمعیت باقی خواهد ماند، یک روش آزمایش مالتی پلکس برای بیماریهای متعدد باید به عنوان یک آزمایش معمول آزمایش در آینده در نظر گرفته شود.
مراجع:
- Giri, Basant, et al. "Review of analytical performance of COVID-۱۹ detection methods." Analytical and bioanalytical chemistry (۲۰۲۰): ۱-۱۴.
- U.S. FDA. FAQs on emergency use authorizations [EUAs] for medical devices during the COVID-۱۹ pandemic. FDA. ۲۰۲۰.
- CDC. CDC ۲۰۱۹-Novel coronavirus [۲۰۱۹-nCoV] real-time RT-PCR diagnostic panel https://www.fda.gov/media/۱۳۴۹۲۲/ download. Accessed ۲ July ۲۰۲۰.
- Diao B,Wen K, Chen J, Liu Y, Yuan Z, Han C, et al. Diagnosis of acute respiratory syndrome coronavirus ۲ infection by detection of nucleocapsid protein. medRxiv. ۲۰۲۰
- Cheng MP, Papenburg J, Desjardins M, Kanjilal S, Quach C, Libman M, et al. Diagnostic testing for severe acute respiratory syndrome–related coronavirus-۲: a narrative review. Ann Intern Med. ۲۰۲۰.
- Yang T, Wang Y-C, Shen C-F, Cheng C-M. Point-of-care RNA-based diagnostic device for COVID-۱۹. Diagnostics. ۲۰۲۰;۱۰:۱۶۵.
محمد حسین مسعودی
کارشناس ارشد مهندسی پزشکی
دپارتمان مهندسی پزشکی، معاونت غذا و دارو
دانشگاه علوم پزشکی ایران
